Riset Praktikum PCR dan Elektroforesis DNA Mx

         

PCR (polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi)DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidangbiokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. PCR (Polimerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1.    Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat (“patokan”) bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.

2.    Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60 °C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.

3.    Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara ksponensial

Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur(reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’ DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5’ ke 3’ atau berarti dari ujung 3’ ke 5’ untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA. Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2ⁿ – 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).

Bisa kita bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 2²⁰ – 2.20 = 1.048576 – 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas 20 untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi 20.970.720, suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak.

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 10⁶-10⁷ kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2ⁿ kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amp

lifikasi urutan non-target.

Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.

Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi oleh enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan. Dasar siklus PCR ada 30-35 siklus meliputi:

Rincian dari masing-masing tahap atau siklus tersebut adalah sebagai berikut : 

Pra-denaturasi

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu), sehingga DNA utas ganda terdenaturasi atau terpisah menjadi dua utas tunggal. Kandungan Guanine dan Cytosine (G+C), yang merupakan pasangan basa nitrogen dengan ikatan rangkap tiga dalam struktur double helix DNA, dapat menjadi pertimbangan menentukan suhu denaturasi. Makin tinggi proporsi (G+C) mengakibatkan makin tingginya suhu yang dibutuhkan untuk denaturasi DNA.

Denaturasi

Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96⁰C selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda yang tersisa, akan dipisah menjadi utas tunggal secara utuh.

Anealing

Tahap awal sintesis sekuen spesifik DNA secara in vitro dimulai pada tahap annealing, Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.Primer akan menempel pada sekuen komplementer utas tunggal DNA cetakan (DNA template). Sintesis DNA ini berlangsung dari arah 5’ ke 3’.  Agar sintesis DNA dapat berlangsung dengan baik maka dalam reaksi tersebut diperlukan adanya enzim DNA polymerase, misalnya Taq Thermus aquaticus) polymerase dan MgCl, sementara kebutuhan energi dan nukleotida terpenuhi dari dNTPs (terdiri dari : dTTP, dGTP, dATP dan dCTP).  Reaksi sintesis DNA pada tahap ini tergantung pada suhu annealing dari primer yang digunakan.  Suhu annealing primer tersebut ditentukan diantaranya dari ukuran panjang primer dan kandungan basa (G+C) dari primer yang digunakan.  Misalnya primer yang terdiri dari 24-30 pasang basa, dapat bekerja dengan baik pada suhu annealing 60 ⁰C atau lebih.

Extension/ elongasi

Pada tahap extension, umumnya terjadi pada suhu 72 ⁰C, proses sintesis yang telah dimulai dari tempat penempelan primer, terus berlanjut sampai bertemu dengan sintesis DNA yang dilakukan oleh primer lainnya dengan arah yang berlawanan pada komplemen utas DNA template, sehingga terbentuklah DNA utas ganda yang baru. Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir

G.    Kesimpulan

1.      Teknik  PCR adalah amplifikasi/pengkopian DNA target diluar sel (in vitro) yang meniru proses replikasi DNA yang ada dalam sel.

2.      Tahapan PCR meliputi:

(1) Pre-denaturasi DNA template

(2) Denaturasi DNA template

(3) Penempelan primer pada template (annealing)

(4) Pemanjangan primer (extension)

(5) Pemantapan (postextension).

H.    Daftar Pustaka           

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2002. Molecular Biology of the Cell. Edisi ke-4. Garland Science: New York. ISBN 0-8153-3218-1 (versi online di NCBI Bookshelf).

Gumilar, Gun Gun. 2006. Memfotokopi DNA dengan PCR. http://www.pikiranrakyat.com/cetak/2006/092006/14/cakrawala/lain03.htm. [diakses 30 November 2014]

Lina, Maria et al. 2005. Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction untuk Mendeteksi Keberadaan Gen Target INH (KAT-G dan KAS-A) pada DNA sampel Sputum BTA (Basil Tahan Asam) Positif yang Dideteksi dengan Beberapa Metode. Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik Nuklir P3TkN-batan.

1.       

I.       Simpulan :

Kesimpulan dari laporan praktikum kali ini adalah sebagai berikut:

-           Mahasiswa mampu memahami dan menerapkan Isolasi dengan metode MN

-           Setelah memahami dan menerapkan Isolasi DNA metode MN  di laboratorium mahasiswa mampu menjelaskan tentang prinsip Isolasi DNA menggunakan metode MN  secara standar operasional prosedur yang benar pada makanan dan darah

-          Kesalahan karena salah uji dalam kerja di laboratorium sangat bisa ditanggulangi dengan memahami dengan baik serta focus dalam setiap melakukan uji isolasi DNA MN karena banyak melalui proses.

-          Meyode Isolasi DNA dengan menggunakan Metode MN ini lebih efisien dari pada metode Isolasi Dixit dan PCI yang banyak membutuhkan bahan

J.       Daftar Pustaka           

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2002. Molecular Biology of the Cell. Edisi ke-4. Garland Science: New York. ISBN 0-8153-3218-1 (versi online di NCBI Bookshelf).

Irawan, Bambang. 2008. Genetika Molekuler. Surabaya: Airlangga University Press. Surabaya.

Jusuf, 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Bogor : Sagung Seto.

Mustikaningtyas, Dewi. 2014. Praktikum Biologi Molekuler. Semarang:Jurusan Biologi, FMIPA, UNNES. 

Nagel, Macherey. 2012. Genomic DNA from Blood User Manual. Germany : Clontech                    Laboratories.

Nagel, Macherey. 2012. Genomic DNA from Food User Manual. Germany : Clontech                     Laboratories.

Sutomo, 2002. Ekstraksi DNA. Jakarta: UI Press.